一，實驗背景與目的(dí)
DNA文庫構建(jiàn)的質量已(yǐ)成(chéng)為決定(dìng)測(cè)序(xù)結果準(zhǔn)確(què)性和(hé)可靠性的(dí)關鍵環(huán)節(jié)。在(zài)文(wén)庫(kù)製(zhì)備(bèi)過(guò)程中，DNA片段化處(chǔ)理(lǐ)是核(hé)心(xīn)步驟之一，其片(piàn)段(duàn)大小(xiǎo)分布的均一性(xìng)和準確(què)性直接影響(xiǎng)後續測(cè)序(xù)的質(zhì)量(liáng)和(hé)效(xiào)率。理想(xiǎng)的(dí)DNA片段化(huà)應具備(bèi)隨(suí)機(jī)性（確(què)保全(quán)基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆蓋(gài)），準(zhǔn)確(què)性(xìng)（保(bǎo)證(zhèng)測序(xù)質量）和集中(zhōng)無(wú)偏(piān)差(chà)（提高測序深度）三(sān)大特征。
本(běn)次實驗(yàn)是(shì)由南京鼓(gǔ)樓(lóu)醫(yī)院委托開(kāi)展(zhǎn)，旨(zhǐ)在利用非(fēi)接觸(chù)DNA打(dǎ)斷(duàn)儀JXDNA-500PICO，通(tōng)過超(chāo)聲工作(zuò)時(shí)間(jiān)20秒，間歇10秒(miǎo)的(dí)工作模式(shì)，將(jiāng)人全(quán)血(xiě)gDNA全(quán)基(jī)因組(zǔ)樣品進(jìn)行200-500bp區(qū)間(jiān)的(dí)片(piàn)段化(huà)處理，以滿(mǎn)足(zú)二代(dài)測(cè)序(xù)文(wén)庫構建的需求。
二(èr)，實驗(yàn)儀(yí)器介(jiè)紹
本(běn)次實驗應用的(dí)是昆(kūn)山(shān)小美超聲-高通(tōng)量聲波基(jī)因(yīn)組剪(jiǎn)切(qiē)儀(yí)JXDNA-500PICO，它是一款采用等(děng)溫(wēn)，非(fēi)接(jiē)觸(chù)方(fāng)式對樣品進(jìn)行打斷，匀漿和混(hùn)合的(dí)實驗(yàn)設備。該(gāi)儀(yí)器采用磁致伸縮(suō)共振超(chāo)聲技(jì)術，通過(guò)三組原(yuán)裝ibidi多(duō)頻超聲(shēng)波換能(néng)器實(shí)現能量均衡輸出，多種超(chāo)聲(shēng)頻(pín)率同時工作(zuò)，能(néng)量輸(shū)出(chū)均衡，超聲密(mì)度均(jūn)一(yī)，確(què)保每(měi)個樣本獲得一(yī)致的(dí)處(chǔ)理(lǐ)效果(guǒ)。儀器(qì)配備(bèi)自動旋轉(zhuǎn)馬達，在(zài)超聲過(guò)程中連續(xù)旋(xuán)轉離心(xīn)管適(shì)配(pèi)器，進一(yī)步(bù)保證(zhèng)超聲能量分布(bù)的(dí)均匀(yún)性。
高通量(liáng)聲(shēng)波基(jī)因(yīn)組剪切DNA打斷(duàn)儀(yí)設備(bèi)的主(zhǔ)要技術優勢(shì)包(bāo)括(kuò)：通(tōng)量(liáng)高，一次(cì)最多可同時處理30個(gè)樣品(pǐn)；各樣品均(jūn)在單(dān)獨(dú)的(dí)全(quán)封閉試管中完成(chéng)處理，有效避免交叉汙(wū)染；采用(yòng)4℃低溫水(shuǐ)浴超(chāo)聲(shēng)波係統，樣品在低(dī)溫環(huán)境(jìng)中進行處(chǔ)理，有效避免DNA變(biàn)性；配(pèi)備(bèi)7寸(cùn)醫用級電(diàn)阻(zǔ)觸(chù)摸屏(píng)，可實(shí)時顯示工(gōng)作(zuò)參(cān)數，支持功(gōng)率，時間(jiān)，脈(mài)衝間(jiān)隙(xì)等參(cān)數的精細調節(jié)，操作簡(jiǎn)便直觀。
三，實驗(yàn)材料與方(fāng)法(fǎ)
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
● 樣(yàng)品來源：人全血(xiě)基(jī)因組DNA（gDNA）
● DNA濃(nóng)度：10ngμL
● 樣品體積：50μL/管
● 離心管(guǎn)規(guī)格：0.2mL EP管
3.2 實(shí)驗步驟
● 預冷處(chǔ)理(lǐ)：提(tí)前(qián)15分(fēn)鐘(zhōng)啟(qǐ)動儀器冷(lěng)水(shuǐ)機，設(shè)置溫(wēn)度(dù)為(wéi)4℃，確(què)保超聲水(shuǐ)槽(cáo)達(dá)到穩(wěn)定的(dí)低溫(wēn)環境。低(dī)溫(wēn)環(huán)境(jìng)對於維持DNA分子的完(wán)整性至(zhì)關(guān)重要，可(kě)有(yǒu)效(xiào)防止(zhǐ)超(chāo)聲過(guò)程中因(yīn)局部升(shēng)溫導致的DNA變(biàn)性或降解。
● 樣品(pǐn)準備：將每個(gè)0.2mL EP管中加入(rù)50μL濃度為10ng/μL的(dí)全(quán)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA溶液。為(wéi)保證實驗(yàn)的(dí)準確性(xìng)和可重(zhòng)復性，所有(yǒu)樣品均使用(yòng)同(tóng)一(yī)批(pī)次試(shì)劑和耗材(cái)。
● 適(shì)配器(qì)裝載(zǎi)：將(jiāng)2管(guǎn)裝好樣(yàng)品(pǐn)的0.2 mL EP管(guǎn)分(fēn)別放(fàng)入(rù)儀(yí)器(qì)的適(shì)配器(qì)當(dāng)中。為確(què)保超聲能(néng)量分布(bù)均(jūn)匀，其他(tā)空餘(yú)的孔位(wèi)由加入(rù)同樣(yàng)體(tǐ)積水的0.2 mL EP管補(bǔ)齊。這(zhè)一(yī)步驟(zhòu)對於保證超聲場(cháng)均匀性具(jù)有重(zhòng)要意義，空(kōng)孔會導致能量分布不均，影響打(dǎ)斷(duàn)效(xiào)果。
● 程(chéng)序設置(zhì)：設置DNA打斷儀(yí)的超聲工作參數如溫度(dù)4℃，超聲工作(zuò)時間20秒，間隔時間(jiān)10秒；總(zǒng)時長分別設置(zhì)為(wéi)10分鐘，15分鐘和20分鐘三個梯(tī)度進行對比。
● 片段(duàn)化(huà)檢(jiǎn)測(cè)：程(chéng)序(xù)結束後，取出樣品，使(shǐ)用毛細管電泳進(jìn)行基因(yīn)組片段化檢測(cè)，分析(xī)片段大(dà)小分(fēn)布(bù)及(jí)均一性。
四，實驗結果(guǒ)與(yǔ)分析
4.1 20分鐘處(chǔ)理(lǐ)組(zǔ)結(jié)果
● 在溫度(dù)4℃，超聲工作時間(jiān)20秒(miǎo)，間隔10秒(miǎo)，總(zǒng)時(shí)長(cháng)20分(fēn)鐘的(dí)條(tiáo)件下，毛(máo)細管電(diàn)泳檢測結果顯示
● 平均(jūn)片(piàn)段大小：303.5bp，200-500bp區間(jiān)占比：56.1%
該結果表明，在(zài)此(cǐ)處理條件下，樣(yàng)品DNA被(bèi)成功打(dǎ)斷(duàn)至(zhì)目(mù)標區(qū)間(jiān)範圍內(nèi)，平(píng)均片段大小(xiǎo)接近300bp的理(lǐ)想(xiǎng)值(zhí)，符合二(èr)代(dài)測序(xù)文(wén)庫(kù)構建對片(piàn)段(duàn)大小的要(yào)求。
4.2 結(jié)果討論
從實(shí)驗結果可(kě)以(yǐ)看出(chū)，小美(měi)超聲(shēng)JXDNA-500PICO非接(jiē)觸(chù)DNA打斷儀(yí)在(zài)處理(lǐ)人(rén)血(xiě)gDNA樣(yàng)品時(shí)表現(xiàn)出良好的片段化(huà)效果。其中(zhōng)200-500bp區(qū)間(jiān)的(dí)片(piàn)段占比達到56.1%，平(píng)均片(piàn)段大(dà)小為303.5bp，基本(běn)滿足(zú)實驗預(yù)期目標。非接(jiē)觸(chù)式處理模(mó)式確(què)保了樣(yàng)品在全封閉環境(jìng)中(zhōng)完(wán)成打斷(duàn)，避(bì)免了傳(chuán)統探頭式超聲帶(dài)來的(dí)交叉汙(wū)染風險(xiǎn)，同(tóng)時低溫環境有效(xiào)保護了(liǎo)DNA分子的完(wán)整(zhěng)性。
五，實驗的(dí)注(zhù)意事項(xiàng)
為(wéi)確保實驗結果的(dí)準確性和可重(zhòng)復(fù)性，在(zài)實(shí)際操(cāo)作(zuò)中(zhōng)需(xū)特別(bié)注意以(yǐ)下(xià)事(shì)項(xiàng)：
● 預冷充分：務(wù)必(bì)提(tí)前(qián)15分鐘啟動冷水(shuǐ)機並(bìng)設(shè)置溫(wēn)度(dù)為(wéi)4℃，使(shǐ)超聲(shēng)水槽(cáo)充(chōng)分預(yù)冷(lěng)。溫(wēn)度控製(zhì)對於(yú)維持(chí)DNA穩(wěn)定(dìng)性至(zhì)關重(zhòng)要，溫度波動(dòng)可能(néng)導致(zhì)DNA變性(xìng)或打(dǎ)斷效(xiào)果不(bù)一(yī)致(zhì)。
● 耗材選(xuǎn)擇(zé)：建(jiàn)議(yì)使(shǐ)用TPX材質(zhì)的EP管，管子(zǐ)的材質(zhì)會(huì)顯(xiǎn)著影(yǐng)響超聲(shēng)打(dǎ)斷(duàn)效果。不同材(cái)質的離(lí)心(xīn)管對(duì)超聲(shēng)波(bō)的吸收和(hé)透射特性存在(zài)差(chà)異，選(xuǎn)擇合適的耗(hào)材(cái)是獲(huò)得理想(xiǎng)打斷(duàn)效果的前提條件。
● 人員配合(hé)：客(kè)戶(hù)在(zài)做(zuò)實(shí)驗(yàn)時一(yī)定(dìng)要安排技術(shù)人員跟隨老(lǎo)師(shī)一(yī)起(qǐ)操作，全程參與(yǔ)實驗過(guò)程(chéng)。這(zhè)樣(yàng)可以在實(shí)驗過程(chéng)中(zhōng)及時發(fā)現(xiàn)並(bìng)解決問(wèn)題，若後續(xù)結果(guǒ)不理想(xiǎng)，也便(biàn)於(yú)追(zhuī)溯(sù)原因，分(fēn)析(xī)影響因素，避免(miǎn)因操(cāo)作細(xì)節(jié)差異(yì)導(dǎo)致的(dí)結(jié)果(guǒ)偏差(chà)。
● 孔(kǒng)位(wèi)補(bǔ)齊(qí)：裝載樣(yàng)品(pǐn)時(shí)，空餘(yú)孔(kǒng)位(wèi)須(xū)用(yòng)加入等體積水的EP管補齊(qí)，以保證超聲能量在(zài)各(gè)孔(kǒng)位間(jiān)的均匀(yún)分布(bù)。
● 參(cān)數優(yōu)化：不同(tóng)來源，不(bù)同(tóng)濃度的DNA樣(yàng)品可能(néng)需要(yào)微調超(chāo)聲(shēng)參數(shù)，建議在進行(háng)正式(shì)實驗前進(jìn)行預實驗，確定最(zuì)佳(jiā)處理條件(jiàn)。
本次(cì)實驗成(chéng)功(gōng)利(lì)用小(xiǎo)美超(chāo)聲(shēng)非接(jiē)觸(chù)DNA打斷(duàn)儀(yí)JXDNA-500PICO將人(rén)血gDNA樣(yàng)品打斷(duàn)至200-500bp區(qū)間，在(zài)超聲20秒(miǎo)，間歇10秒(miǎo)，總時(shí)長(cháng)20分(fēn)鐘(zhōng)的(dí)條件下(xià)，獲得平均(jūn)片段大小303.5bp，目標(biāo)區(qū)間占(zhān)比(bǐ)56.1%的理想(xiǎng)結(jié)果。該(gāi)設(shè)備(bèi)以(yǐ)其高通量，無交叉汙染(rǎn)，低溫保(bǎo)護(hù)，操作(zuò)簡便等優勢，為高通(tōng)量(liáng)測(cè)序樣本(běn)製備中(zhōng)的DNA片段(duàn)化(huà)提供(gōng)了可(kě)靠的解決方案(àn)！